一、   簡介
GST親和層析介質(zhì)（GST Agarose）是專門設(shè)計用于純化谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶以及與谷胱甘肽有親和作用蛋白的分離介質(zhì)，一步分離就可得到高純度的GST融合目標蛋白，純化條件溫和，可以保證蛋白的活性。
本產(chǎn)品是自主設(shè)計合成的GST瓊脂糖凝膠，具有優(yōu)良的物理和化學穩(wěn)定性，使用壽命長，操作方便，批次重復性好，易于放大，是研發(fā)與生產(chǎn)的理想選擇。


二、   適用范圍
分離谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（GST）融合蛋白、其它谷胱甘肽轉(zhuǎn)移酶以及與谷胱甘肽有親和作用的蛋白。
三、   操作說明
1.  緩沖液配制
       緩沖液A（平衡緩沖液）：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，調(diào)節(jié)pH值至8.0。
       緩沖液B（洗脫緩沖液）：10mM Glutathione（還原型），50mM Tris-HCl，調(diào)節(jié)pH值至8.0。因Glutathione易氧   化，需現(xiàn)用現(xiàn)配。
（注：各種溶液配制完畢后，{zh0}進行脫氣處理，0.45 μm濾膜過濾備用)。
2.  樣品預處理：
按每克濕重菌體/2~5ml平衡緩沖液的比例充分懸浮離心收集的菌體；600w功率，每循環(huán)超聲3s，冷卻3s，循環(huán)99×3次,破碎菌體；4℃、15000rpm離心15m，收集上清液，或用0.45μm濾膜過濾。
3.   裝柱：
      聚苯乙烯層析柱
1)  將層析柱固定在鐵架臺或?qū)游黾苌?，封閉層析柱下端出口，向柱內(nèi)充入純水，排開層析柱內(nèi)空氣，先將墊片wq浸沒于水面下方，在保持水平的狀態(tài)下，小心推向底部，避免墊片下方滯留氣泡。
2)  打開層析柱下端出口，排出柱中純水；在液面低至距墊片1~1.5cm高度時封閉下端出口，用移液槍按需要量吸取介質(zhì)，或用玻璃棒緊靠柱子內(nèi)壁引流，將介質(zhì)加入到層析柱中；靜置30min，讓介質(zhì)自然沉降。
3)  從上端管口將另一墊片緩慢推至介質(zhì)沉降平面，使介質(zhì)表面保持水平狀態(tài)，注意避免墊片與介質(zhì)接觸面滯留氣泡（如對實驗結(jié)果要求不嚴，也可不放入上墊片，以提高流速）。
4)  在使用一段時間后，如果層析柱流速減慢，可先用小鑷子沿邊緣將墊片tf，夾出墊片，倒出介質(zhì)，清洗或更換新的墊片后，按2）、3）所述
     玻璃層析柱
1)  將層析柱洗凈后垂直固定到鐵架臺上；向柱中加入蒸餾水，排開柱子中的空氣，在蒸餾水排盡以前，關(guān)閉柱子出口，在柱內(nèi)保留5~8cm高度的蒸餾水。
2)  先將介質(zhì)混勻，用移液槍按需要量吸取介質(zhì)，或用玻璃棒緊靠柱子內(nèi)壁引流，將介質(zhì)加入到層析柱中；靜置30min，讓介質(zhì)自然沉降。
3)  從上端管口將轉(zhuǎn)換桿出液端緩慢推至介質(zhì)沉降平面，使介質(zhì)表面保持水平狀態(tài)，注意避免轉(zhuǎn)換桿與介質(zhì)接觸面間滯留氣泡。
4)  在使用一段時間后，如果流速減慢，可先卸下上轉(zhuǎn)換桿，將介質(zhì)倒出，再取出下轉(zhuǎn)換接頭中濾網(wǎng)，清洗或更換后重新裝柱。
4.  過柱：
1)  用10倍介質(zhì)體積緩沖液A過柱，平衡介質(zhì)；
2)  上樣；
3)   用5~10倍介質(zhì)體積緩沖液A過柱，洗去層析柱中剩余上樣液并重新平衡介質(zhì)；
4)   用5~10倍介質(zhì)體積緩沖液B洗脫，收集洗脫液；
5)   用5~10倍介質(zhì)體積緩沖液A重新平衡介質(zhì)。
注：純化過程流速不宜過快，對于1ml介質(zhì)，流速保持在0.5ml/min為宜。
5.  介質(zhì)清洗
如果在使用一段時間后，介質(zhì)因表面沉積過多雜質(zhì)導致蛋白結(jié)合能力下降，需對介質(zhì)進行清洗。步驟如下：
1)  沉淀或變性物質(zhì)的清洗：
用2倍介質(zhì)體積6 M鹽酸胍清洗，然后用5倍介質(zhì)體積緩沖液A平衡介質(zhì)。
2)  疏水締合物質(zhì)的清洗：
用3~4倍介質(zhì)體積70%乙醇 (或2倍介質(zhì)體積去垢劑，如 1% Triton? X-100) 清洗介質(zhì)；然后用5倍介質(zhì)體積緩沖液A平衡介質(zhì)。
6. 介質(zhì)再生
每次層析前，為達到{zj0}純化效果，需對介質(zhì)進行再生，步驟如下：
1)  2倍介質(zhì)體積高pH緩沖液（0.1M Tris-HCl, 0.5M NaCl, pH8.5）和低pH緩沖液（0.1M sodium acetate, 0.5M NaCl, pH4.5）交替洗脫三次。
2) 10倍介質(zhì)體積緩沖液A平衡介質(zhì)。


7.SDS-PAGE檢測
1)   SDS-PAGE操作流程
A.    每個膠孔最適蛋白上樣量為5~10μg。
B.    將含5~10μg蛋白的樣品溶液與loading buffer混勻，90℃孵育5min，取出后5000rpm離心1 min。
C.    上樣，15mA、30mA恒流或80V、120V恒壓電泳。


8.介質(zhì)保存
4℃~8℃條件下，介質(zhì)可長期保存于20%乙醇中。
四、   GST Agarose分離GST融合蛋白實例
         層析介質(zhì)：GST 1ml；對照GST介質(zhì)（國際{lx1}品牌）1ml
         樣品：表達可溶性GST-tag融合thioredoxin的大腸桿菌BL21裂解液
         結(jié)合緩沖液：10mM Na2HPO4，1.8mM KH2PO4，140mM NaCl，2.7mM KCl，pH 8.0
         洗脫緩沖液：10 mM Glutathione（還原型）, 50 mM Tris-HCl, pH8.0
         流速：GST 1ml，0.5ml/min；對照GST介質(zhì)1ml，0.5ml/min
實驗結(jié)果：
色譜分析結(jié)果見圖1，色譜各組分的SDS-PAGE結(jié)果見圖2。
圖1 GST Agarose分離GST融合蛋白色譜圖




1.低分子量Marker；2.上樣液；
3.GST-流穿液；4.GST-洗脫液；
5.對照-流穿液；6.對照-洗脫液
 
1    2    3    4    5    6
圖2  純化后SDS-PAGE圖


 
五、GST親和層析介質(zhì)使用注意事項
1.  GST融合蛋白與還原型谷胱甘肽的結(jié)合比較緩慢，為獲得{zd0}結(jié)合量，需要保證足夠的作用時間，因而在上樣時要維持較低流速。在樣品中加入5~10mM DTT可以增加介質(zhì)對目標蛋白的吸附。對于按常規(guī)步驟操作吸附效果不好的樣品，可以先把介質(zhì)和樣品混合，輕輕振搖2~4h，再裝柱，用平衡緩沖液進行重新平衡、洗脫等操作。
2.  不同的GST融合蛋白取得{zj0}純化效果所需還原型谷胱甘肽濃度、洗脫體積和洗脫時間可能有所不同。必要時需對流穿液、洗脫液進行SDS-PAGE以及Western雜交分析，以確定{zj0}純化條件。
3.GST融合蛋白以包涵體形式存在時不能與介質(zhì)結(jié)合，必須先進行變性、復性、透析處理后才能用介質(zhì)進行純化。純化效果取決于復性效率。
4.純化后出現(xiàn)雜帶的常見原因
1)  目標蛋白斷裂或酶解
解決方案：向緩沖液A和緩沖液B中加入1mM PMSF抑制蛋白酶活性，或0.1％TritonX-100或0.1％Tween-20等穩(wěn)定劑。
2)  GST融合蛋白不wq表達
GST融合蛋白有時候只表達到GST部分就終止，GST標簽蛋白連同wq表達的融合蛋白均能與介質(zhì)結(jié)合并被洗脫下來，因而洗脫液中出現(xiàn)26KD左右的雜帶。
解決方案：嘗試用不同濃度的還原型谷胱甘肽洗脫；優(yōu)化表達條件，降低GST融合蛋白不wq表達量；改變外源基因在載體中插入的酶切位點，重新構(gòu)建表達載體；在不改變外源基因兩端酶切位點的情況下，更換通用載體。
5.　如后續(xù)實驗需要除去洗脫液中還原型谷胱甘肽，可采用超濾或透析的方法。
六、GST標簽切除
GST標簽可用位點專一的蛋白酶如凝血酶或Xa因子從融合蛋白中切除。蛋白酶解后，再用GST親和層析方法去除GST標簽，目標蛋白存在于流出液中。一般情況下，與切除GST標簽后得到的外源蛋白相比，凝血酶用量極小，如果后續(xù)實驗要求不嚴格，不需進一步除去與外源蛋白共存與洗脫液中的凝血酶。如需除去凝血酶，則可將樣品用pH7~8的緩沖液溶解，然后直接過1ml的苯甲脒瓊脂糖凝膠或者肝素瓊脂糖凝膠吸附凝血酶。